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HJ 347.2-2018 水质 粪大肠菌群的测定 多管发酵法

发布时间:2021-10-09 14:21:44 丨 浏览次数:

8 样品

8.1 样品采集

    点位布设及采样频次按照 GB/T 14581、HJ/T 494 和 HJ/T 91 的相关规定执行。

    采集微生物样品时,采样瓶(7.1)不得用样品洗涤,采集样品于灭菌的采样瓶中。清 洁水体的采样量不低于 400 ml,其余水体采样量不低于 100 ml。

    采集河流、湖库等地表水样品时,可握住瓶子下部直接将带塞采样瓶插入水中,约距水 面 10~15 cm 处,瓶口朝水流方向,拔瓶塞,使样品灌入瓶内然后盖上瓶塞,将采样瓶从水中取出。如果没有水流,可握住瓶子水平往前推。采样量一般为采样瓶容量的 80%左右。样品采集完毕后,迅速扎上无菌包装纸。

    从龙头装置采集样品时,不要选用漏水龙头,采水前将龙头打开至最大,放水 3~5 min, 然后将龙头关闭,用火焰灼烧约 3 min 灭菌或用 70%~75%的酒精对龙头进行消毒,开足龙头,再放水 1 min,以充分除去水管中的滞留杂质。采样时控制水流速度,小心接入瓶内。

    采集地表水、废水样品及一定深度的样品时,也可使用灭菌过的专用采样装置采样。 在同一采样点进行分层采样时,应自上而下进行,以免不同层次的搅扰。

    如果采集的是含有活性氯的样品,需在采样瓶灭菌前加入硫代硫酸钠溶液(6.7),以除去活性氯对细菌的抑制作用(每 125 ml 容积加入 0.1 ml 的硫代硫酸钠溶液);如果采集的是重金属离子含量较高的样品,则在采样瓶灭菌前加入乙二胺四乙酸二钠溶液(6.8),以消除干扰(每 125 ml 容积加入 0.3 ml 的乙二胺四乙酸二钠溶液)。

    注:15.7 mg 硫代硫酸钠(6.5)可去除样品中 1.5 mg 活性氯,硫代硫酸钠用量可根据样品实际活性氯量调整。

8.2 样品保存

    采样后应在 2 h 内检测,否则,应 10℃以下冷藏但不得超过 6 h。实验室接样后,不能立即开展检测的,将样品于 4℃以下冷藏并在 2 h 内检测。

9 分析步骤

9.1 样品稀释及接种

9.1.1 15 管法

    将样品充分混匀后,在 5 支装有已灭菌的 5 ml 三倍乳糖蛋白胨培养基(6.2)的试管中(内有倒管),按无菌操作要求各加入样品 10 ml,在 5 支装有已灭菌的 10 ml 单倍乳糖蛋白胨培养基(6.1)的试管中(内有倒管),按无菌操作要求各加入样品 1 ml,在 5 支装有已灭菌的 10 ml 单倍乳糖蛋白胨培养基(6.1)的试管中(内有倒管),按无菌操作要求各加入样品 0.1 ml。

    对于受到污染的样品,先将样品稀释后再按照上述操作接种,以生活污水为例,先将样 品稀释 104 倍,然后按照上述操作步骤分别接种 10 ml、1  ml 和 0.1 ml。15 管法样品接种量参考表见表 1。

    当样品接种量小于 1 ml 时,应将样品制成稀释样品后使用。按无菌操作要求方式吸取10ml 充分混匀的样品,注入盛有 90 ml 无菌水(6.4)的三角烧瓶中,混匀成 1:10 稀释样品。

    吸取 1:10 的稀释样品 10 ml 注入盛有 90 ml 无菌水的三角烧瓶中,混匀成 1:100 稀释样品。其他接种量的稀释样品依次类推。

    注:吸取不同浓度的稀释液时,每次必须更换移液管。

    生活饮用水等清洁水体也可使用 12 管法。

HJ 347.2-2018 水质 粪大肠菌群的测定 多管发酵法(图1)

10.1.112 管法

    将样品充分混匀后,在 2 支装有已灭菌的 50 ml 三倍乳糖蛋白胨培养基(6.2)的大试管中(内有倒管),按无菌操作要求各加入样品 100 ml,在 10 支装有已灭菌的 5 ml 三倍乳糖蛋白胨培养基(6.2)的试管中(内有倒管),按无菌操作要求各加入样品 10 ml。

9.2 初发酵试验

    将接种(9.1)后的试管,在 37℃±0.5℃下培养 24 h±2 h。

    发酵试管颜色变黄为产酸,小玻璃倒管内有气泡为产气。产酸和产气的试管表明试验阳 性。如在倒管内产气不明显,可轻拍试管,有小气泡升起的为阳性。

9.3 复发酵试验

    轻微振荡在初发酵试验(9.2)中显示为阳性或疑似阳性(只产酸未产气)的试管,用 经火焰灼烧灭菌并冷却后的接种环(7.5)将培养物分别转接到装有 EC 培养基(6.3)的试管中。在 44.5℃±0.5℃下培养 24 h±2 h。转接后所有试管必须在 30  min 内放进恒温培养箱或水浴锅(7.3)中。培养后立即观察,倒管中产气证实为粪大肠菌群阳性。

9.4 对照试验

9.4.1 空白对照

    每次试验都要用无菌水(6.4)按照步骤 9.1~9.3 进行实验室空白测定。

9.4.2 阳性及阴性对照

    将粪大肠菌群的阳性菌株(如大肠埃希氏菌 Escherichia coli)和阴性菌株(如产气肠杆菌 Enterobacter aerogenes)制成浓度为 300~3000 MPN/L 的菌悬液,分别取相应体积的菌悬液按接种(9.1)的要求接种于试管中,然后按初发酵试验(9.2)和复发酵试验(9.3)要 求培养,阳性菌株应呈现阳性反应,阴性菌株应呈现阴性反应,否则,该次样品测定结果无 效,应查明原因后重新测定。

10 结果计算与表示

10.1 结果计算

    接种 12 份样品时,查附录 A 中表 A.1 可得每升粪大肠菌群 MPN 值。

    接种 15 份样品时,查附录 A 中表 A.2 得到 MPN 值,再按照公式(1)换算样品中粪大肠菌群数(MPN/L):

 HJ 347.2-2018 水质 粪大肠菌群的测定 多管发酵法(图1)

    式中:

    C——样品中粪大肠菌群数,MPN/L;

    MPN 值——每 100 ml 样品中粪大肠菌群数,MPN/100ml;

    100——为 10×10 ml,其中,10 将 MPN 值的单位 MPN/100 ml 转换为 MPN/L,10 ml为 MPN 表中最大接种量;

    f——实际样品最大接种量,ml。

10.2 结果表示

    测定结果保留至整数位,最多保留两位有效数字,当测定结果≥100 MPN/L 时,以科学计数法表示;当测定结果低于检出限时,12 管法以“未检出”或“<3 MPN/L”表示;15 管法以“未检出”或“<20   MPN/L”表示。粪大肠菌群检验记录及报告推荐格式参见附录B。

11 精密度和准确度

11.1 精密度

    6 个实验室对低浓度(地下水,浓度均值为 54 MPN/L)、中浓度(地表水,浓度均值为 2.7×104 MPN/L)和高浓度(生活污水,浓度均值为 2.8×107 MPN/L)三个不同浓度粪大肠菌群的实际样品和有证标准样品( 浓度为 3670 MPN/L , 可接受范围为 330 ~ 7710 MPN/L)进行了 6 次重复测定:实验室内相对标准偏差范围分别为 2.3%~3.8%、2.0%~11%、1.1%~5.4%和 5.1%~17%;实验室间相对标准偏差分别为 3.4%、11%、1.6%和 5.4%; 实验室间 95%置信区间见表 2。

HJ 347.2-2018 水质 粪大肠菌群的测定 多管发酵法(图3)

11.2 准确度

    6 个实验室对含粪大肠菌群浓度为 3670 MPN/L(可接受范围为 330~7710 MPN/L)的标准样品进行了 6 次重复测定: 相对误差范围为-6.2% ~ 8.4%; 相对误差最终值为-1.7%±10.6%。

    注:微生物检测数据为偏态分布,其测定结果全部经以 10 为底对数转换后进行计算。

12 质量保证和质量控制

12.1 培养基检验

    更换不同批次培养基时要进行阳性和阴性菌株检验,将粪大肠菌群的阳性菌株(如大肠 埃希氏菌 Escherichia coli)和阴性菌株(如产气肠杆菌 Enterobacter aerogenes)制成浓度为300~3000 MPN/L 的菌悬液。若使用的是定性标准菌株,配制方法为先进行预实验,摸清浓度后按目标为 300~3000 MPN/L 稀释;若使用的是定量标准菌株,则可按照给定值直接稀释。稀释后分别取相应水量的菌悬液按接种(9.1)的要求接种于试管中,然后按初发酵试 验(9.2)和复发酵试验(9.3)要求培养,阳性菌株应呈现阳性反应,阴性菌株应呈现阴性 反应。

 

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