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HJ 1001-2018 水质 总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的测定 酶底物法

发布时间:2021-10-07 17:10:57 丨 浏览次数:

7 样品

7.1 样品采集

    点位布设及采样频次按照 GB/T 14581、HJ/T 494 和 HJ/T 91 的相关规定执行。

    采集微生物样品时,采样瓶(7.1)不得用样品洗涤,采集样品于灭菌的采样瓶中。

    采集河流、湖库等地表水样品时,可握住瓶子下部直接将带塞采样瓶插入水中,约距水 面 10~15 cm 处,瓶口朝水流方向,拔瓶塞,使样品灌入瓶内然后盖上瓶塞,将采样瓶从水中取出。如果没有水流,可握住瓶子水平往前推。采样量一般为采样瓶容量的 80%左右。样品采集完毕后,迅速扎上无菌包装纸。

    从龙头装置采集样品时,不要选用漏水龙头,采水前将龙头打开至最大,放水 3~5 min, 然后将龙头关闭,用火焰灼烧约 3 min 灭菌或用 70%~75%的酒精对龙头进行消毒,开足龙头,再放水 1 min,以充分除去水管中的滞留杂质。采样时控制水流速度,小心接入瓶内。

    采集地表水、废水样品及一定深度的样品时,也可使用灭菌过的专用采样装置采样。 在同一采样点进行分层采样时,应自上而下进行,以免不同层次的搅扰。

    如果采集的是含有活性氯的样品,需在采样瓶灭菌前加入硫代硫酸钠溶液(6.4),以除去活性氯对细菌的抑制作用(每 125 ml 容积加入 0.1 ml 的硫代硫酸钠溶液);如果采集的是重金属离子含量较高的样品,则在采样瓶灭菌前加入乙二胺四乙酸二钠溶液(6.5),以消除干扰(每 125 ml 容积加入 0.3 ml 的乙二胺四乙酸二钠溶液)。

    注:15.7 mg 硫代硫酸钠(6.2)可去除样品中 1.5 mg 活性氯,硫代硫酸钠用量可根据样品实际活性氯量调整。

7.2 样品保存

    采样后应在 2 h 内检测,否则,应 10℃以下冷藏但不得超过 6 h。实验室接样后,不能立即开展检测的,将样品于 4℃以下冷藏并在 2 h 内检测。

8 分析步骤

8.1 样品稀释

    根据样品污染程度确定接种量(见表 1),避免接种样品培养后 97 孔定量盘(6.6)出现全部阳性或全部阴性。接种量小于 100 ml  时,应稀释样品后接种,接种量为 10 ml 时, 取 10 ml 样品加入到盛有 90 ml 无菌水(6.8)的三角瓶(7.7)中混匀制成 1:10 的稀释样品, 其他接种量的稀释样品依次类推。对于未知样品,可选用多个接种量进行检测。

HJ 1001-2018 水质 总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的测定 酶底物法(图1)

8.2 接种

    量取 100 ml 样品或稀释样品于灭菌后的三角瓶,加入 2.7 g±0.5 g 培养基(6.1)粉末, 充分混匀,完全溶解后,全部倒入 97 孔定量盘(6.6)内,以手抚平 97 孔定量盘背面,赶

    除孔内气泡,然后用程控定量封口机(7.4)封口。观察 97 孔定量盘颜色,若出现类似或深于标准阳性比色盘(6.7)的颜色,则需排查样品、培养基、无菌水等一系列因素后,终止 试验或重新操作。

    注:9.1、9.2 步骤在野外操作时应避开明显局部污染源,建议使用一次性手套、口罩、酒精灯等。

8.3 培养

    测定总大肠菌群和大肠埃希氏菌时,将封口后的 97 孔定量盘放入恒温培养箱(7.3)中37℃±1℃下培养 24 h。

    测定粪大肠菌群时,将封口后的 97 孔定量盘放入的恒温培养箱中 44.5℃±0.5℃下培养24 h。

8.4 对照试验

8.4.1 空白对照

    每次试验都要用无菌水(6.8)按照步骤 9.1~9.3 进行实验室空白测定。培养后的 97 孔定量盘不得有任何颜色反应,否则,该次样品测定结果无效,应查明原因后重新测定。

8.4.2 阴性和阳性对照

    总大肠菌群、大肠埃希氏菌、粪大肠菌群的阴性、阳性菌株参考表 2。

 HJ 1001-2018 水质 总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的测定 酶底物法(图2)

    将标准菌株制成 300~3000 个/ml 的菌悬液,将菌悬液按接种(9.2)和培养(9.3)要求操作,阳性菌株应呈现阳性反应;阴性菌株呈现阴性反应,否则,该次样品测定结果无效, 应重新测定。

    注:可先制备较高浓度菌悬液,采用血球计数器在显微镜下对其浓度进行初步测定,然后根据实际情况用无菌水(6.8)稀释至 300~3000 个/ml。

8.4.3 结果判读与计数

    将培养 24 h 后的 97 孔定量盘进行结果判读,样品变黄色判断为总大肠菌群或粪大肠菌群阳性;样品变黄色且在紫外灯(7.5)照射下有蓝色荧光,判断为大肠埃希氏菌阳性。如 果结果可疑,可延长培养至 28 h 进行结果判读,超过 28 h 后出现的颜色反应不作为阳性结果。可使用保质期内的标准阳性比色盘以辅助判读,参见附录 A。

    分别记录 97 孔定量盘中大孔和小孔的阳性孔数量。

9 结果计算与表示

9.1 结果计算

    从 97 孔定量盘法 MPN 表(见附录 B)中查得每 100 ml 样品中总大肠菌群、粪大肠菌群数或大肠埃希氏菌的 MPN 值(置信区间参见附录 C)后,再根据样品不同的稀释度,按照公式(1)换算样品中总大肠菌群、粪大肠菌群数或大肠埃希氏菌浓度(MPN/L):

 HJ 1001-2018 水质 总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的测定 酶底物法(图3)

    式中:

    C——样品中总大肠菌群、粪大肠菌群数或大肠埃希氏菌浓度,MPN/L;

    MPN 值——每 100 ml 样品中总大肠菌群、粪大肠菌群数或大肠埃希氏菌浓度,MPN/100 ml;

    1000——将 C 单位由 MPN/ ml 转换为 MPN/L;

    f ——最大接种量,ml。

9.2 结果表示

    测定结果保留两位有效数字,当测定结果≥100 MPN/L 时,以科学计数法表示;若 97孔均为阴性,可报告为总大肠菌群、粪大肠菌群数或大肠埃希氏菌未检出或<10  MPN/L。

10 精密度和准确度

10.1 精密度

    6 个实验室分别对低浓度(地下水,浓度均值为 6.0×102 MPN/L)、中浓度(地表水,浓度均值为 4.0×104 MPN/L)和高浓度(生活污水,浓度均值为 9.0×107 MPN/L)三个不同浓度细菌总数的样品及有证标准样品(浓度为 2000 MPN/L)进行了 6 次重复测定:实验室内相对标准偏差范围分别为 0.26%~1.3%、0.65%~2.0%、1.3%~3.7%和 0.68%~2.8%;实验室间相对标准偏差分别为 9.9%、1.3%、4.2%和 1.3%;重复性限为 0.17、0.18、0.21 和 0.18; 再现性限为 1.8、0.23、0.38 和 0.20;实验室间置信区间见表 3。

 

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