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HJ 1016-2019 水质 致突变性的鉴别 蚕豆根尖微核试验法

发布时间:2021-09-17 17:21:05 丨 浏览次数:

9 样品

9.1 样品采集

    按照HJ/T 91 或HJ/T 164 的要求进行样品采集,根据样品性质选用1 000 ml 及以上容量的采样瓶。采样瓶可以为棕色玻璃瓶或聚丙烯、聚四氟乙烯、聚乙烯材质的容器。采样时应注意将样品沿瓶壁缓慢倒入采样瓶,样品与瓶塞之间不留空隙。

    注:为保证尽快开展测试,采样时间应尽量安排在催根(8.3)步骤的末期。

9.2 样品保存

    样品采集后,于 8℃以下冷藏避光保存,在 48 h 内进行试验。样品若需长期保存,须充分混匀分装并留有适当空隙,于-18℃以下冷冻保存,保存期不超过 2 个月。

9.3 试样制备

    样品在恒温培养箱(6.3)中 25℃±1 ℃避光平衡至恒温,充分混匀后,加满至根尖处理皿(6.7),与盖板间略留空隙,待测。测试前按照 GB/T 6920 方法测定并记录 pH 值。在-18℃以下保存的样品,应先在不超过 25℃的水浴中轻微振荡解冻,或在 8℃以下冷藏过夜解冻。

    注:试样适宜的 pH 值范围为 5.5~8.5,过高或过低的 pH 值可能会对试验产生影响。当试验结果需包含该影响,或者调节 pH 值会引起样品物理变性、化学反应时,则不调节样品 pH 值;当样品 pH<5.5 或>8.5 时,可用盐酸溶液(5.10)或氢氧化钠溶液(5.11)调节 pH 值至适宜范围。根据监测目的,可单独或同时对调节前、后的试样开展试验。

9.4 对照试样

9.4.1 用实验用水代替样品,按照与试样制备(9.3)相同步骤制备用于阴性对照试验的空白试样。

9.4.2 以环磷酰胺参比溶液(5.17)代替样品,按照与试样制备(9.3)相同步骤制备用于阳性对照试验的参比试样。

10 分析步骤

10.1 根尖处理

    挑选初生根长 1.5 cm~2.0 cm 且生长发育良好的豆种(8.3),在 9.3 步骤的每个根尖处理皿中插入 10~12 粒豆种,确保根尖没入试样至少 1.0 cm,于恒温培养箱(6.3)中 25℃±1 ℃避光放置 6 h。

    取出豆种,用调温水(5.1)浸洗 3 次(每次 5 min)后,按照 8.3 规定的条件恢复培养24 h。

    处理过程中,根尖如出现附录 D 中描述的急性毒性症状,则按附录 D 的要求增加试样急性毒性预试验;否则,直接进行后续试验。

10.2 根尖固定

    切取顶端 l.0 cm 左右根尖(10.1)置于具盖指管内(同一试样处理的根尖放入一个指管),加卡诺氏液(5.12)固定 2 h。固定时间最长不超过 24 h。

    如不能及时染色制片,则弃去卡诺氏液,用实验用水洗净,加入乙醇溶液(5.13)浸没, 于冰箱内冷藏,72 h 内染色镜检。

10.3 孚尔根(Feulgen)染色

    实验用水浸洗根尖(10.2)2 次,每次 5 min。取 60℃水浴平衡后的盐酸溶液(5.10),快速加入指管内直至浸没根尖,指管加盖后放入 60℃水浴锅中水解约 10 min,具体时间以根尖软化呈白色略带透明,镊子轻捏不破、有弹性为准。快速弃除盐酸溶液。

    立即用实验用水浸洗上述根尖 2 次,每次 5 min。在指管中加入席夫试剂(5.14)直至浸没根尖,在暗室或避光条件下染色 1 h~2 h。弃除染液,用 SO2 漂洗液(5.15)浸洗根尖2 次,每次 5 min;再用实验用水浸洗根尖 2 次,每次 5 min。

    如不能立即制片,将根尖浸泡于新换的实验用水中,冰箱内冷藏,48 h 内制片镜检。

10.4 制片

    用镊子轻取染色效果良好的根尖(10.3),在滤纸上吸净表面水分,置于载玻片上,用手术刀截取约 l.0  mm~2.0  mm 处的顶部根尖(参见附录 A 图 A.2),滴加 1 滴乙酸分散液(5.16)浸没根尖,手术刀充分捣碎,加盖玻片(避免产生气泡),盖玻片上叠放滤纸,轻轻敲打以分散根尖组织,拇指按压制成薄片,使根尖细胞呈单层分散状。

10.5 镜检

    将制备好的压片(10.4)置于生物显微镜(6.2)下,低倍镜下观察找出根尖细胞接近方形或椭圆形、分布均匀、不重叠的区域,转入高倍镜下镜检。每一试样至少观察 6 个根尖,按 10.6 判定规则对每个根尖进行以下统计:

    a)1 000 个细胞中处于有丝分裂期的细胞数;

    b)1 000 个处于有丝分裂间期细胞中的微核数。

10.6 有丝分裂细胞及微核判定

10.6.1 细胞有丝分裂过程包含分裂间期和有丝分裂期两个阶段,其中有丝分裂期细胞的识别参见附录A 图 A.1。

10.6.2 按照以下规则判定微核:

    a)大小为主核的 1/3 以下,且与主核分离或相切;

    b)着色反应和折光性与主核一致,内部有明显的染色质颗粒,色泽比主核稍浅或相 当;

    c)形态圆形、椭圆形或不规则。

    形态类似微核,但不符合上述特征,尤其是折光性与主核不一致、内部无明显染色质颗粒、着色较深或过浅的颗粒即为伪微核。微核及伪微核判定参见附录 A 图A.3。

10.7 对照试验

10.7.1 阴性对照

    每批试样测试时,空白试样(9.4.1)按 10.1~10.6 步骤进行阴性对照试验。

10.7.2 阳性对照

    每批试样测试时,参比试样(9.4.2)按 10.1~10.6 步骤进行阳性对照试验。

11 结果计算与表示

11.1 结果计算

    a)每一根尖有丝分裂指数按公式(1)计算:

 HJ 1016-2019 水质 致突变性的鉴别 蚕豆根尖微核试验法(图1)

    式中:

    I——单个根尖有丝分裂指数(保留一位小数),‰;

    M——观察 1 000 个细胞中所有处于有丝分裂期的细胞数,个。

    b)被测试样微核率按公式(2)计算:

 HJ 1016-2019 水质 致突变性的鉴别 蚕豆根尖微核试验法(图2)

    式中:

    MCN——被测试样的微核率(保留一位小数),‰;

    Ri——被测试样第 i 个根尖 1 000 个有丝分裂间期细胞中的微核数,个;

    n——同一被测试样中观察根尖的总数(≥6),个。

    注:试样微核率、空白试样微核率和参比试样微核率分别以 MCN 试样、MCN 空白和 MCN 参比表示。

11.2 结果判定

    在本测定方法下,试样致突变性按以下条件判断:

    a) MCN试样≤实验室历史累积MCN空白上限(参考值6.6‰),则该试样不存在致突变性;

    b) MCN试样>实验室历史累积MCN空白上限(参考值6.6‰),且本次MCN试样较MCN空白显著增加,则该试样存在致突变性;

    c) MCN试样>实验室历史累积MCN空白上限(参考值6.6‰),但本次MCN试样较MCN空白无显著增加,则该试样疑似存在致突变性。

 

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