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HJ 1069-2019 水质 急性毒性的测定 斑马鱼卵法

发布时间:2021-08-28 16:41:46 丨 浏览次数:

9 试验步骤

9.1 配种

    试验前一天傍晚开始斑马鱼种鱼(6.1.1)配种,将洗净晾干后的产卵盒(7.9)内缸套入外缸,插入隔板,加入约 2/3 缸标准稀释水(6.2.16),选取体长及鱼龄相当、性发育特征明显、健康活跃的雌雄种鱼,在左右两个隔间中分别加入 1 尾雌鱼和 2 尾雄鱼,盖上盖板,于恒温培养箱或恒温室(7.6)中避光放置过夜。

    按以上步骤至少进行 3 组种鱼的配种。

9.2 产卵及鱼卵初筛

    次日光照开始后,打开产卵盒(7.9)盖板,提取内缸,弃去外缸内的水后再放回内缸, 沿内缸壁小心加入标准稀释水(6.2.16),以水面距内缸底部约 2 个种鱼体宽为宜,避免伤害种鱼。抽开隔板,让雌雄种鱼交配产卵,30 min 后检查各缸种鱼产卵情况,分别收集已产卵各缸内相应鱼卵,用标准稀释水(6.2.16)冲洗至结晶皿中,在恒温培养箱或恒温室(7.6)中静置 45 min 后,结晶皿以黑底相衬,侧面加以灯光观察,每个结晶皿中随机选取鱼卵 20 粒按照附录D.1 的方法识别受精鱼卵,避免伤害鱼卵。统计每组种鱼所产鱼卵的受精率,至少选取受精率≥70%的 3 组鱼卵混合备用。

9.3 暴露试验

    将已配制好的不同浓度的稀释水样按附录 E 设置的试验布局加至多孔细胞培养板(7.8), 每孔 2 ml。

    上述稀释水样各取 60 ml~70 ml 于不同的培养皿中,用塑料滴管(7.11)在备用鱼卵中各取圆润、饱满、完整的 20 粒加入上述培养皿中,将各培养皿在倒置显微镜或体视显微镜(7.4)下逐一进行观测,选取 4-细胞期~128-细胞期(参见附录 A)的受精卵,去除在细胞分裂时有明显异常(如不对称、有囊泡或无卵膜等)或者卵膜损伤的鱼卵。在已加入水样的多孔细胞培养板(7.8)对应孔中各加入 1 粒受精卵,盖上盖板。

    以上操作过程应在鱼卵(9.2)静置 45 min 后 60 min 内完成。

    将上述多孔细胞培养板(7.8)于恒温培养箱或恒温室(7.6)中,按附录 B 的水温和光照条件进行 48 h 暴露试验。

9.4 鱼卵镜检判定测试终点

    以卵凝结、体节未形成、尾部未分离及无心跳为测试终点,判定方法如下(参见附录 D.2):

    a)卵凝结

    凝结的鱼卵显微镜下内含物完全不透明,质地较硬。在肉眼观察下凝结的鱼卵呈不透明及灰暗的状态。

    b)体节未形成

    鱼卵卵黄囊外侧胚胎中后部,无体节者为体节未形成。

    c)尾部未分离

    正常发育的鱼卵,胚胎的尾部会伸长,与卵黄囊相分离。若无,则表明尾部未分离。若48 h 后,胚胎尾部分离程度与 24 h 时相比未有明显变化,同样也判定为尾部未分离。

    d)无心跳

    斑马鱼卵胚胎心脏位于卵黄囊与胚胎头部间,观测该区域是否有节律的震动,若无,则表明无心跳。

    将上述暴露试验的多孔细胞培养板(7.8)置于倒置显微镜或体视显微镜(7.4)下按表2 要求进行鱼卵镜检。

    鱼卵暴露 24 h 和 48 h 后,出现任一测试终点情况则判定鱼卵死亡,统计每一稀释水样鱼卵的存活率和死亡率。

表 2 鱼卵镜检观测要求

测试终点

卵凝结

体节未形成

尾部未分离

无心跳

观测方式

显微镜或肉眼

显微镜

显微镜

显微镜

观测

时间

暴露24 h

+

+

+

-

暴露48 h

+

+

+

+

注:“+”表示观测、判断并记录,“-”表示无需此观测。

9.5 对照试验

    每批水样试验时,按附录 E 试验布局及 9 步骤进行对照试验。

    a)微孔板对照

    以标准稀释水(6.2.16)为水样进行微孔板对照试验。

    b)阴性对照

    以标准稀释水(6.2.16)为水样进行阴性对照试验。

    c)阳性对照

    以 3,4-二氯苯胺工作液(6.2.11)为水样进行阳性对照试验。

    以上 9 试验步骤均使用标准稀释水(6.2.16)用于配种(9.1)、产卵及鱼卵初筛(9.2)、微孔板对照和阴性对照试验(9.5),应按 8.2.1 步骤平衡水温至 26℃±1 ℃,并用空气曝气至溶解氧浓度至少达到空气饱和值的 80%。所涉实验室温度控制在 26℃左右,恒温培养箱或恒温室(7.6)温度控制在 26℃±1℃。

10 结果计算与表示

    鱼卵存活率在 90%及以上的最低稀释倍数,即为最低无效应稀释倍数 LID。LID 的结果应为整数,如 LID=2。

    水样 EC50 可按附录 G 方法计算,也可采用概率单位法、直线内插法等其他方法来计算。结果保留至小数点后 1 位。

11 有效性、敏感性与精密度

11.1 有效性及敏感性

    六家实验室对阴性对照水样(6.2.16 标准稀释水)进行了 6 次重复测定:存活率介于90%~100%。

    六家实验室对阳性对照水样(6.2.11 参比物质 3,4-二氯苯胺工作液)进行了 6 次重复测定:死亡率介于 40%~60%。

 

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